Кофактори та коферменти

Дата добавления: 2014-07-26 | Просмотров: 1879

Більшість ферментів для прояву ферментативної активності потребує низькомолекулярних органічних сполук небілкової природи (коферменти) і/або йони металів (кофактори).

Термін «кофермент» був введений на початку ХХ ст. і позначав частину деяких ферментів, яка легко відділялася від білкової молекули ферменту і видалялася через напівпроникну мембрану під час діалізу. Дещо пізніше було встановлено, що більшість ферментів складається з термолабільної білкової частини і термостабільного небілкового фактору – коферменту. Білкова частина отримала назву «апофермент», який за відсутністю коферменту не володіє каталітичною активністю. Кофермент з білковою молекулою (апоферментом) формують молекулу холоферменту, що володіє каталітичною активністю.

Кофактори

Більше 25% всіх ферментів для прояву повної каталітичної активності потребують наявності іонів металів. Розглянемо роль кофакторів у ферментативному каталізі.

Йони металу виконують функцію стабілізаторів молекули субстрату, активного центру ферменту і конформації білкової молекули ферменту, а саме третинної і четвертинної структур.

Йони металів – стабілізатори молекули субстрату. Для деяких ферментів субстратом слугує комплекс перетворюваної речовини з йоном металу. Наприклад, для більшості кіназ у якості одного з субстратів виступає не молекула АТФ, а комплекс Mg²⁺-АТФ. В цьому випадку йон Mg²⁺ не взаємодіє безпосередньо з ферментом, а задіяний у стабілізації молекули АТФ і нейтралізації від’ємного заряду субстрату, що полегшує його приєднання до активного центру ферменту:

Схематично роль кофактору під час взаємодії ферменту і субстрату можна представити як комплекс E–S–Me, де Е – фермент, S – субстрат, Ме – йон металу.

В якості прикладу можна навести розміщення субстратів в активному центрі гексокінази (рис. 3).

Гексокіназа каталізує перенесення кінцевого, γ-фосфатного залишку молекули АТФ на глюкозу з утворенням глюкозо-6-фосфату:

Іон Mg²⁺ бере участь у приєднанні й «правильній» орієнтації молекули АТФ в активному центрі ферменту послаблюючи фосфоефірний зв’язок і полегшуючи перенесення фосфату на глюкозу.

Йони металу – стабілізатори активного центру ферменту. В деяких випадках йони металу слугують «містком» між ферментом і субстратом. Вони виконують функцію стабілізаторів активного центру полегшуючи приєднання до нього субстрату і протікання хімічної реакції. У частині випадків йон металу може сприяти приєднанню коферменту. Перераховані вище функції виконують такі метали, як Mg²⁺, Mn²⁺, Zn²⁺, Co²⁺, Mo²⁺. За відсутності металу ці ферменти не активні. Такі ферменти отримали назву «металоензими». Схематично даний процес взаємодії ферменту, субстрату і металу можна зобразити наступним чином: Е – Ме – S.

До металоензимів належить, наприклад, фермент піруваткіназа (рис. 4), що каталізує реакцію:

Йони металів забезпечують зберігання вторинної, третинної, четвертинної структури молекули ферменту. Такі ферменти за відсутності йонів металів здатні до хімічного каталізу, але вони є нестабільними. Їхня активність знижується і навіть повністю зникає внаслідок невеликих змін рН, температури та інших незначних змін зовнішнього середовища. Таким чином, йони металів виконують функцію стабілізаторів оптимальної конформації білкової молекули.

Іноді у стабілізації вторинної і третинної структури приймають участь йони лужних і лужно-земельних металів. Так, для підтримання третинної конформації піруваткінази потрібні йони К⁺.

Для стабілізації четвертинної структури алкогольдегідрогенази, що каталізує реакцію окислення етанолу, необхідні йони цинку. Алкоголь-дегідрогеназа складається з чотирьох субодиниць з молекулярною масою 151 кД. До складу ферменту входять 4 атоми Zn²⁺. Видалення Zn²⁺ призводить до втрати ферментом активності за рахунок дисоціації на 4 неактивні субодиниці з молекулярною масою 36 кД (рис. 5).

Роль металів у ферментативному каталізі. Не менш важлива роль відводиться йонам металів в здійсненні ферментативного каталізу.

Під час електрофільного каталізу йони металів часто приймають участь в стабілізації проміжних сполук. Найчастіше цю функцію виконують йони металів зі змінною валентністю, що мають вільну d-орбіталь і виступають в якості електрофілів. Це в першу чергу такі метали, як Zn²⁺, Fe²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺. Йони лужних металів, такі як Na⁺ і К⁺ не володіють такою властивістю. У якості прикладу можна розглянути функціонування ферменту карбоангідрази. Карбоангідраза – цинквмісний фермент, що каталізує реакцію утворення вугільної кислоти:

СО₂ + Н₂О ↔ Н₂СО₃.

Йон Zn²⁺ в результаті гідрофільної атаки цинк-ензиму приймає участь в утворенні Н⁺ і ОН^– йонів з молекули води:

Протон і гідроксильна група послідовно приєднуються до діоксиду вуглецю з утворенням вугільної кислоти:

Йони металів зі змінною валентністю можуть також приймати участь в перенесенні електронів. Наприклад, у цитохромах (гемвмісних білках) йон заліза здатен приєднувати і віддавати один електрон:

Завдяки цій властивості, цитохроми приймають участь в окисно-відновних реакціях.

Інший приклад участі йонів металів в окисно-відновних реакціях – робота ферменту дофамінгідроксилази, що каталізує реакцію утворення норадреналіну за участю вітаміну С:

За окисно-відновні властивості дофамінгідроксилази відповідає йон міді (рис. 6).

Фрагмент, що містить йон Cu²⁺, не вступає в реакцію з молекулою кисню. Під час відновлення Cu²⁺ до Cu⁺ за допомогою аскорбінової кислоти утворюється йон міді, здатний взаємодіяти з киснем з утворенням перекисної сполуки. Далі гідроксильна група переноситься на молекулу дофаміну з утворенням норадреналіну.

Роль металів у регуляції активності ферментів. Іноді йони металів виступають у ролі регуляторних молекул. Наприклад йони Cа²⁺ слугують активаторами ферменту протеїнкінази С, що каталізує реакції фосфорилювання білків. Йони Cа²⁺ також змінюють активність ряду кальцій-кальмодулінзалежних ферментів.

Коферменти

Як вже було зазначено для прояву каталітичної активності більшості ферментів необхідною є наявність коферменту. Виключення складають гідролітичні ферменти (наприклад, протеази, ліпази, рибонуклеаза), що виконують свою функцію за відсутності коферменту.

Кофермент, локалізуючись у каталітичній ділянці активного центру, приймає безпосередню участь в хімічній реакції, виступаючи у якості акцептора і донора хімічних груп, атомів, електронів. Кофермент може бути зв’язаним з білковою частиною молекули ковалентними і нековалентними зв’язками. У першому випадку він називається простетичною групою (наприклад, FAD, FMN, біотин, ліпоєва кислота). Разом з тим відомі приклади, коли кофермент приєднується до ферменту нековалентними зв’язками настільки міцно, що не дисоціює від білкової молекули, наприклад тіаміндифосфат.

У другому випадку кофермент взаємодіє з ферментом тільки під час хімічної реакції і може розглядатися у якості другого субстрату. Приклади – NAD⁺, NADP⁺.

Апофермент забезпечує специфічність дії і відповідає за вибір типу хімічного перетворення субстрату. Один і той же кофермент, взаємодіючи з різними апоферментами, може приймати участь у різних хімічних перетвореннях субстрату. Наприклад, піридоксальфосфат в залежності від того, з яким апоферментом він взаємодіє, приймає участь у реакціях трансамінування або карбоксилювання амінокислот.

Хімічна природа коферментів, їхні функції у ферментативних реакціях є надзвичайно різноманітними. Традиційно до коферментів відносять похідні вітамінів, хоча крім них існує значний клас небілкових сполук, що приймають участь у прояві каталітичної функції ферментів.

До коферментів належать наступні сполуки:

· похідні вітамінів;

· геми, що входять до складу цитохромів, каталази, пероксидази, гуанілатциклази, NO-синтази і є простетичною групою ферментів;

· нуклеотиди – донори і акцептори залишку фосфорної кислоти;

· убіхінон, або кофермент Q, що задіяний у перенесенні електронів і протонів у дихальному ланцюзі;

· фосфоаденозилфосфосульфат, що приймає участь у перенесенні сульфату;

· S-аденозилметіонін (SAM) – донор метильної групи;

· глутатіон, що приймає участь в окисно-відновних реакціях.

Будова і функції цих коферментів докладно розглянуті у відповідних розділах підручника.

Мультисубстратні реакції

Більшість ферментів каталізує реакції, в яких приймає участь більше одного субстрату. У випадку якщо кофермент не є простетичною групою, його також можна розглядати як ще один субстрат. Отже, учасників ферментативної реакції може бути декілька: безпосередньо фермент, кілька субстратів і кофермент.

У таких випадках механізм ферментативної реакції, як правило, може відбуватися за одним з двох шляхів: за механізмом «пінг-понг» (механізм подвійного заміщення) або послідовним. Розглянемо обидва механізми.

Схематично механізм «пінг-понг» можна зобразити наступним чином:

Субстрат А, взаємодіючи з ферментом (Е), перетворюється на продукт (Р₁). У результаті цього перетворення фермент залишається не в нативній формі, а в зміненій (Е') у результаті модифікації коферменту. Далі до активного центру Е' приєднується субстрат В, що перетворюється на продукт (Р₂) із вивільненням нативної форми ферменту Е.

Гарний приклад механізму «пінг-понг» – реакції трансамінування за участю ферментів амінотрансфераз (кофермент – піридоксальфосфат). Амінотрансферази, відкриті радянським вченим А.Е. Браунштейном, каталізують оборотні реакції перенесення аміногрупи з амінокислоти на кетокислоту. Механізм «пінг-понг» даної реакції схематично представлений на рис. 7.

Інший приклад механізму «пінг-понг» – реакції дегідрування за участю коферменту FAD (флавінаденіндинуклеотид) або FMN (флавінмоно-нуклеотид), які міцно зв’язані з ферментом і, відповідно, не можуть розглядатися в якості другого субстрату.

Схематично структура цих коферментів і відповідні їм хімічні формули наведені на рис. 8.

FMN і FAD приймають участь в окисно-відновних реакціях, акцептуючи 2 е^– і 2 Н⁺ в ізоалаксазинове кільце:

Схему реакції дегідрування (як приклад механізму «пінг-понг» за участю коферментів FAD і FMN) можна представити наступним чином:

де АН₂ – донор водню, що окислює субстрат 1; А – окислена форма субстрату 1; В – акцептор водню – субстрат 2; ВН₂ – відновлена форма субстрату 2, (FAD), (FADH₂) – окислена й відновлена форми коферменту FAD, що входить до складу ферменту Е.

В якості прикладу FAD-залежної реакції можна привести сукцинат-дегідрогеназну реакцію. В цій реакції у якості другого субстрату задіяний убіхінон – один з посередників у дихальному ланцюзі:

У випадку послідовного механізму для перебігу ферментної реакції потрібна одночасна взаємодія двох субстратів. В такому випадку можливе приєднання субстратів двома різними шляхами:

1) Механізм впорядкованої взаємодії субстрату з активним центром ферменту:

Першим до активного центру ферменту приєднується субстрат А, полегшуючи приєднання субстрату В. Після хімічної модифікації також спостерігають певний порядок вивільнення продуктів реакції.

2) Механізм випадкової взаємодії субстрату з активним центром ферменту:

Пріоритетності у взаємодії субстратів А і Б з активним центром ферменту немає (кожен субстрат має свій центр зв’язування у активному центрі). Також немає чіткої закономірності у вивільненні продуктів реакції.

Прикладом послідовного впорядкованого механізму може бути реакція дегідрування за участю коферментів NAD⁺, NADP⁺.

Схематично структура і хімічні формули цих коферментів наведені на рис. 9.

Обидва коферменти функціонують як посередники у перенесенні двох електронів і одного протону від донора до акцептора, і другого протону – в середовище:

Донор і акцептор не обов’язково приймають участь в одному метаболічному шляху. Іншими словами, відновлена форма цих нуклеотидів діє як загальний пул електронів, утворений в результаті окисних реакцій, і може бути використана в різних відновних реакціях. Такі реакції називають спряженими:

де АН₂ – донор водню, відновлена форма субстрату 1; А – окислена форма субстрату 1; В – акцептор водню – другий субстрат; ВН₂ – відновлена форма субстрату 2; NAD⁺, NADH – окислена і відновлена форми коферменту; Е₁ і Е₂ – ферменти.

Дві ферментативні реакції, що каталізуються ферментами Е₁ і Е₂, спряжені одна з одною за допомогою NAD⁺, що слугує субстратом у кожному з цих випадків. Для першого ферменту субстратом є окислена форма NAD⁺, у якості другого субстрату виступає донор водню (приклад послідовних реакцій), а продуктом є відновлена форма NAD; для Е₂ – навпаки.

Як приклад можна розглянути наступні спряжені реакції (схема нижче), де Е₁ – гліцеральдегідфосфатдегідрогеназа, Е₂ – лактатдегідро-геназа.