Інгібування ферментативної активності

Дата добавления: 2014-07-26 | Просмотров: 1836

Під терміном «інгібування ферментативної активності» розуміють зниження каталітичної активності в присутності певних речовин – інгібіторів. До інгібіторів відносять речовини, що викликають зниження активності ферменту. Потрібно зазначити, що всі денатуруючі агенти також викликають зменшення швидкості будь-якої ферментативної реакції, внаслідок неспецифічної денатурації білкової молекули, тому денатуруючі агенти до інгібіторів не відносять.

Інгібітори викликають велику зацікавленість під час вивчення механізмів ферментативного каталізу, допомагають встановити роль окремих ферментів у метаболічних шляхах організму. В основі дії багатьох лікарських препаратів і отрут лежить інгібування активності ферментів, тому знання механізмів цього процесу є дуже важливим для молекулярної фармакології і токсикології.

Інгібітори здатні взаємодіяти з ферментами з різним ступенем міцності. На основі цього розрізняють зворотне і незворотне інгібування. За механізмом дії інгібітори поділяють на конкурентні й неконкурентні.

Зворотне інгібування

Зворотні інгібітори зв’язуються з ферментами слабкими нековалентними зв’язками і за певних умов легко відокремлюються від ферменту.

До конкурентного інгібування відносять зворотне зниження швидкості ферментативної реакції, викликане інгібітором, що зв’язався з активним центром ферменту й перешкоджає утворенню ферментсубстратного комплексу. Такий тип інгібування спостерігають, коли інгібітор є структурним аналогом субстрату. В результаті даного типу інгібування виникає конкуренція молекул субстрату та інгібітора за місце зв’язування в активному центрі ферменту. В такому випадку з ферментом взаємодіє або субстрат, або інгібітор, утворюючи комплекси фермент – субстрат (ES) або фермент – інгібітор (ЕІ). Внаслідок формування комплексу ферменту та інгібітора продукт реакції не утворюється (рис. 21).

Для конкурентного типу інгібування справедливі наступні рівняння:

E + S ↔ ES → E + P

E + I ↔ EI

Класичний приклад конкурентного інгібування – інгібування сукцинат-дегідрогеназної реакції малоновою кислотою (рис. 22). Малонова кислота – структурний аналог сукцинату (наявність двох карбоксильних груп) і може також взаємодіяти з активним центром сукцинатдегідрогенази. Але відщеплення двох атомів водню від малонової кислоти є неможливим; отже, швидкість реакції знижується.

Конкурентні інгібітори зменшують швидкість хімічної реакції. Конкурентний інгібітор підвищує K_m для даного субстрату (зменшує спорідненість субстрату до ферменту). Це означає, що в присутності конкурентного інгібітора необхідна велика концентрація субстрату для досягнення 1/2V_max.

Збільшення співвідношення концентрації субстрату та інгібітора знижує ефективність інгібування. При значно вищих концентраціях субстрату інгібування повністю зникає, тому що активні центри усіх молекул ферменту будуть знаходитися переважно в комплексі з субстратом.

Багато лікарських препаратів чинять свій терапевтичний вплив за механізмом конкурентного інгібування. Наприклад, четвертинні амонієві основи інгібують ацетилхолінестеразу, що каталізує реакцію гідролізу ацетилхоліну на холін і оцтову кислоту:

Внаслідок додавання інгібіторів активність ацетилхолінестерази зменшується, концентрація ацетилхоліну (субстрату) збільшується, що супроводжується посиленням проведення нервового імпульсу. Інгібітори холінестерази використовують у лікуванні м’язової дистрофії. Ефективні антихолінестеразні препарати – прозерин, ендрофоній та ін. (рис. 23).

В якості інгібіторів ферментів за конкурентним механізмом у медичній практиці використовують речовини, що називаються антиметаболітами. Ці сполуки, будучи структурними аналогами природних субстратів, викликають конкурентне інгібування ферментів з одного боку і, з іншого, можуть використовуватися цими ж ферментами в якості псевдосубстратів, що призводить до синтезу аномальних продуктів. Аномальні продукти не володіють функціональною активністю; в результаті спостерігається зниження швидкості певних метаболічних шляхів.

В якості лікарських препаратів використовують наступні антиметаболіти: сульфаніламідні препарати (аналоги параамінобензойної кислоти), що застосовується для лікування інфекційних хвороб, аналоги нуклеотидів для лікування онкологічних захворювань.

Неконкурентним називають таке інгібування ферментативної реакції, при якому інгібітор взаємодіє з ферментом у ділянці, відмінній від активного центру (рис. 24). Неконкурентні інгібітори не є структурними аналогами субстратів.

Неконкурентний інгібітор може зв’язуватися або з ферментом, або з ферментсубстратним комплексом, утворюючи неактивний комплекс. Приєднання неконкурентного інгібітора викликає зміну конформації молекули таким чином, що порушується взаємодія субстрату з активним центром ферменту, що призводить до зниження швидкості ферментативної реакції.

Кінетична залежність неконкурентного інгібування представлена на рис. 25. Цей тип інгібування характеризується зниженням V_max ферментативної реакції та зменшенням спорідненості субстрату до ферменту, тобто збільшенням K_m.

Незворотне інгібування

Незворотне інгібування спостерігають у випадку утворення ковалентних стабільних зв’язків між молекулою інгібітора й ферменту. Найчастіше модифікації зазнає активний центр ферменту. В результаті фермент не може виконувати каталітичну функцію.

До незворотних інгібіторів належать іони важких металів, наприклад ртуті (Hg²⁺), срібла (Ag²⁺) і миш’яку (As³⁺), які в маленьких концентраціях блокують сульфгідрильні групи активного центру. Субстрат при цьому не може піддаватися хімічному перетворенню (рис. 26). За наявності реактиваторів ферментативна функція відновлюється. У великих концентраціях іони важких металів викликають денатурацію білкової молекули ферменту, тобто призводять до повної інактивації ферменту.

Специфічні і неспецифічні інгібітори. Використання незворотних інгібіторів викликає великий інтерес для з’ясування механізму дії ферментів. З цією метою використовують речовини, що блокують певні групи активного центру ферменту. Такі інгібітори називають специфічними. Ряд сполук легко вступає в реакції з певними хімічними групами. Якщо ці групи приймають участь у каталізі, то відбувається інактивація ферменту.

Роль гідроксильних груп серину в механізмі каталізу досліджують за допомогою фторфосфатів, наприклад диізопропілфторфосфату. Диізопропіл-фторфосфат (ДФФ) специфічно реагує лише з одним з багатьох залишків серину в активному центрі ферменту. Залишок Сер, що здатний реагувати з ДФФ, має ідентичне або дуже схоже амінокислотне оточення (табл. 2). Висока реакційна здатність цього залишку в порівнянні з іншими залишками Сер обумовлена амінокислотними залишками, що також входять до активного центру ферменту.

Таблиця 2

Дослідження послідовності амінокислотних залишків

навколо реакційноздатного залишку серину, що взаємодіє з ДФФ

ДФФ належить до специфічних незворотних інгібіторів «серинових» ферментів, тому що він утворює ковалентний зв’язок із гідроксильною групою серину, який знаходиться в активному центрі й відіграє ключову роль у процесі каталізу (рис. 27).

Монойодоцтова кислота, п-хлормеркурібензоат легко вступають в реакції з SH-групами залишків цистеїну білків (рис. 28). Ці інгібітори не належать до специфічних, тому що вони реагують з будь-якими вільними SH-групами білків і називаються неспецифічними інгібіторами. Якщо SH-групи приймають участь безпосередньо в каталізі, то за допомогою цих інгібіторів можливим є визначення ролі SH-груп ферменту в каталізі.

Приклад лікарського препарату, дія якого заснована на необоротному інгібуванні ферментів, – широко використовуваний препарат аспірин. Протизапальний нестероїдний препарат аспірин забезпечує фармакологічну дію за рахунок інгібування ферменту циклооксигенази, що каталізує реакцію утворення простагландинів з арахідонової кислоти. У результаті хімічної реакції ацетильний залишок аспірину приєднується до вільної кінцевої ОН-групи серину циклооксигенази:

Це викликає зниження утворення продуктів реакції простагландинів, які володіють широким спектром біологічних функцій, зокрема є медіаторами запалення.