Анализ гомологичных белков

Дата добавления: 2014-06-18 | Просмотров: 1559

Гомологичные белки — белки, которые выполняют одну и ту же функцию, но различаются по первичной структуре (например, локализованы в различных органах или образуются при патологических состояниях). Например, HbA (содержит Glu) Þ HbS (содержит Val) при серповидноклеточной анемии.

Метод пептидных карт (отпечатков пальцев), предложенный Ингремом

Этапы:

1) оба анализируемых белка расщепляют на фрагменты (пептиды);

2) смесь пептидов каждого белка наносят в виде пятна на угол листа хроматографической бумаги;

3) проводят электрофорез в горизонтальном направлении;

4) проводят распределительную хроматографию в вертикальном направлении;

5) полученные карты окрашивают и сравнивают;

6) различающиеся пептидные пятна выделяют и анализируют.

УСТАНОВЛЕНИЕ АК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ БЕЛКА

Определение N-концевой АК

1. Метод Сэнджера (ФДНБ — фтординитробензол — связывается с N-концевой АК с образованием соединения желтого цвета).

2. Метод Эдмана (используется ФИТЦ — фенилизотиоцианат, который также связывается с N-концевой АК с образованием соединения оранжевого цвета).

3. Дансилирование (взаимодействие N-концевой АК с дансилхлоридом с образованием флуоресцирующего соединения).

4. Ферментативный метод (использование аминопептидаз — это ферменты, которые избирательно отщепляют N-концевые АК, например, аланиновая аминопептидаза).

Определение С-концевой АК

1. Метод Акабори (гидразин разрушает все пептидные связи и реагирует со всеми АК, кроме С-концевой; С-концевую АК определяют после обработки смеси ФДНБ).

2. Ферментативный метод (карбоксипептидазы А отщепляют ароматические С-конце-вые АК, карбоксипептидазы В — основные С-концевые АК).

Определение АК-последовательности

1. Избирательный гидролиз.

2. Определение последовательности АК (используют прибор секвенатор, предложенный Эдманом).